ни использовали вирусную обратную транскриптазу, чтобы вписать в ДНК нужный вариант последовательности. Метод праймированного редактирования (prime editing) позволяет исправлять любой тип мутаций: от точечных замен до вставок или делеций. Исследователи опробовали его на нескольких типах клеток человека и утверждают, что он работает точнее, чем стандартный CRISPR/Cas9 и редакторы оснований. Работа опубликована в журнале Nature.

В основе работы молекулярной системы CRISPR/Cas9 лежит разрезание ДНК: Cas9-нуклеаза вносит разрыв в обе цепи ДНК в нужном месте. Затем клетка может соединить концы разрыва (негомологичное соединение концов) или вставить на место разрыва «заплатку» (гомологичная репарация), позаимствовав материал со второй хромосомы или из предоставленной экспериментатором последовательности. Но двунитевые разрывы могут быть опасными для клетки и вызывать остановку деления или смерть, а способ их починки непросто проконтролировать.

В этом смысле более безопасными являются редакторы оснований — это вариант системы CRISPR/Cas, в котором фермент исправляет только одну «букву» в тексте ДНК, не создавая при этом двунитевых разрывов. Однако редакторы способны исправлять только определенные типы точечных мутаций (Ц→Т, Г→А, А→Г, Т→Ц) и бессильны против других (например, Ц→А или Г→Т).

Чтобы расширить возможности борьбы с мутациями, группа ученых из Гарвардского университета под руководством Дэвида Лю (David Liu) разработала новую стратегию — праймированное редактирование генов. Она не требует внесения двуцепочечных разрывов, а вместо направляющей РНК, которую использует CRISPR/Cas для наведения на цель, в нее входит удлиненная гидовая РНК для праймированного редактирования (prime editing extended guide RNA, pegRNA, пргРНК). Эта РНК выполняет сразу две функции: определяет область, где пройдет редактирование, и несет в себе информацию, которую нужно «вписать» в ген.

Механизм работы новой системы выглядит следующим образом:

1. На нить ДНК садится измененный фермент Cas9, который расплетает дуплекс на две отдельные цепи.
2. ПргРНК «наводится» на участок ДНК, то есть прилипает к одной из нитей, защищая ее. На противоположной нити Cas9 вносит одноцепочечный разрез.
3. Другим своим концом пргРНК прилипает к разрезанной нити.
4. К белку Cas9 присоединен другой фермент — обратная траснкриптаза. Она строит ДНК на основе прг-РНК, тем самым «переписывая» ген заново.
5. В результате получаются две версии одного места ДНК: старая и новая. Одну из них разрушают внутриклеточные нуклеазы, и нередко это оказывается старая.
6. Новую версию белки репарации ДНК «вшивают» на место. При этом новая цепь ДНК и комплементарная ей вторая цепь не совпадают, и белки репарации должны одну из них расщепить, а другую — построить по образцу противоположной. Если добавить в систему еще одну гидовую РНК, которая наводит Cas9 на «неправильную» цепь, то Cas9 вносит в нее разрывы, и белки репарации принимают ее за ошибочную. В итоге получаются две копии нужной последовательности.
   
   

   БиологияМедицина

   18:00 21 Окт. 2019

   Сложность 5.2

   Новый метод редактирования генома оказался точнее классического CRISPR/Cas9

   

   Ученые из Гарварда придумали новый способ редактировать ДНК, а точнее — переписывать ее: они использовали вирусную обратную транскриптазу, чтобы вписать в ДНК нужный вариант последовательности. Метод праймированного редактирования (prime editing) позволяет исправлять любой тип мутаций: от точечных замен до вставок или делеций. Исследователи опробовали его на нескольких типах клеток человека и утверждают, что он работает точнее, чем стандартный CRISPR/Cas9 и редакторы оснований. Работа опубликована в журнале Nature.

   В основе работы молекулярной системы CRISPR/Cas9 лежит разрезание ДНК: Cas9-нуклеаза вносит разрыв в обе цепи ДНК в нужном месте. Затем клетка может соединить концы разрыва (негомологичное соединение концов) или вставить на место разрыва «заплатку» (гомологичная репарация), позаимствовав материал со второй хромосомы или из предоставленной экспериментатором последовательности. Но двунитевые разрывы могут быть опасными для клетки и вызывать остановку деления или смерть, а способ их починки непросто проконтролировать.

   В этом смысле более безопасными являются редакторы оснований — это вариант системы CRISPR/Cas, в котором фермент исправляет только одну «букву» в тексте ДНК, не создавая при этом двунитевых разрывов. Однако редакторы способны исправлять только определенные типы точечных мутаций (Ц→Т, Г→А, А→Г, Т→Ц) и бессильны против других (например, Ц→А или Г→Т).

   Чтобы расширить возможности борьбы с мутациями, группа ученых из Гарвардского университета под руководством Дэвида Лю (David Liu) разработала новую стратегию — праймированное редактирование генов. Она не требует внесения двуцепочечных разрывов, а вместо направляющей РНК, которую использует CRISPR/Cas для наведения на цель, в нее входит удлиненная гидовая РНК для праймированного редактирования (prime editing extended guide RNA, pegRNA, пргРНК). Эта РНК выполняет сразу две функции: определяет область, где пройдет редактирование, и несет в себе информацию, которую нужно «вписать» в ген.

   Механизм работы новой системы выглядит следующим образом:

7. На нить ДНК садится измененный фермент Cas9, который расплетает дуплекс на две отдельные цепи.
8. ПргРНК «наводится» на участок ДНК, то есть прилипает к одной из нитей, защищая ее. На противоположной нити Cas9 вносит одноцепочечный разрез.
9. Другим своим концом пргРНК прилипает к разрезанной нити.
10. К белку Cas9 присоединен другой фермент — обратная траснкриптаза. Она строит ДНК на основе прг-РНК, тем самым «переписывая» ген заново.
11. В результате получаются две версии одного места ДНК: старая и новая. Одну из них разрушают внутриклеточные нуклеазы, и нередко это оказывается старая.
12. Новую версию белки репарации ДНК «вшивают» на место. При этом новая цепь ДНК и комплементарная ей вторая цепь не совпадают, и белки репарации должны одну из них расщепить, а другую — построить по образцу противоположной. Если добавить в систему еще одну гидовую РНК, которая наводит Cas9 на «неправильную» цепь, то Cas9 вносит в нее разрывы, и белки репарации принимают ее за ошибочную. В итоге получаются две копии нужной последовательности.

13.  

    

    Поделиться

     

    Авторы нового метода оценили его эффективность на нескольких типах человеческих клеток. По их подсчетам, успешное редактирование происходит в 20-50 процентах случаев, а частота ошибочных вставок или делеций (инделов) — около 1-10 процентов. Исследователи отмечают, что их система работает эффективнее, чем классическая CRISPR/Cas9 — в аналогичных экспериментах она справилась только примерно в 10 процентах случаев. Кроме того, праймированное редактирование оказалось безопаснее: например, во взрослых нейронах оно вызвало лишь 0,58 процентов инделов, а CRISPR/Cas9 — 31 процент.

     

    Важный плюс нового метода — его универсальность. «Переписывая» последовательность гена, ученые получили возможность устранить любую мутацию — будь то делеция, дупликация или точечная замена. Они проверили: система справляется с любыми заменами нуклеотидов и другими нарушениями последовательности гена. В частности, они исправили в модельных клетках человека мутации, ответственные за серповидно-клеточную анемию, нейродегенеративную болезнь Тея-Сакса и подверженность прионной инфекции. Авторы работы полагают, что их разработка может быть эффективна против 89 процентов патогенных генетических вариаций, которые значатся в базе данных ClinVar, — все они представляют собой небольшие, до 30 нуклеотидов, изменения в последовательности ДНК.

    Споры о безопасности CRISPR/Cas9 и ее аналогов для клеток человека продолжаются. В 2018 году из журнала Nature Methods отозвали статьюо высоком уровне нецелевого редактирования, к которому приводит использование этой системы. Тем не менее, клеточные терапии постепенно движутся к клиническому использованию. Первый шаг в эту сторону сделали в Китае, затем в Америке, а недавно CRISPR-отредактированные клетки впервые использовали для борьбы с ВИЧ-инфекцией.
    
    Оригинал статьи:https://nplus1.ru/news/2019/10/21/prime-editing